Metodi di analisi a risposta rapida più diffusi: enzimatici, immunochimici, molecolari

Metodi di analisi a risposta rapida più diffusi: enzimatici, immunochimici, molecolari

Stefania Iametti del DeFENS, Università degli Studi di Milano, ha fatto un excursus sui metodi di analisi a risposta rapida più diffusi

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21

Ottobre
2019

Tratto dall'intervento di Stefania Iametti - Biochimica Generale - Dipartimento di Scienze per gli Alimenti, la Nutrizione e l'Ambiente - Università degli Studi di Milano

La scelta del metodo di analisi a risposta rapida è strettamente legata ad alcuni aspetti che è necessario considerare: la definizione del limite, i metodi analitici appropriati (qualitativi o quantitativi?), il ruolo dei processi (come il processo che subisce l’alimento può influire sulla capacità del metodo di determinare la presenza del composto in questione?).

A proposito dei limiti, il Reg. CE 1881/06 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari, riporta i limiti fissati per alcune sostanze (esempio il glutine in prodotti per celiaci, le aflatossine totali nei vegetali, l’ocratossina nel latte per infanzia ecc.). Il problema nell’interpretazione del risultato si pone quando non sono fissati i limiti, come ad esempio nel caso degli allergeni.

Le basi analitiche dei metodi sono: la presenza/assenza (determinazioni quantitative/qualitative), le modificazioni compositive, strutturali e funzionali, l’identificazione e quantificazione.
I metodi possono essere fisici, enzimatici, immunochimici.
I METODI FISICI sono basati su taglia, carica, reattività, metodi spettrometrici e separativi.
I METODI ENZIMATICI sono basati sull’identificazione/quantificazione di metaboliti, ma anche per presenza/assenza cofattori (es. crescita batterica con vitamine/nutrienti). L’identificazione si basa sulla variazione di colore.
I METODI IMMUNOCHIMICI, che sono disponibili in vari formati, anche ultrarapidi, si basano sul riconoscimento dell’antigene da parte di un anticorpo specifico (sono possibili difficoltà nell’analisi di alimenti processati e in presenza di interferenti).
I METODI MOLECOLARI PCR & RT-PCR si basano sulla reazione della polimerasi (sono possibili difficoltà nella preparazione del campione a causa di interferenti ed effetti del processo). Questi metodi “vedono” solo DNA.

L’analisi enzimatica può essere utilizzata per misurare la concentrazione di un analita utilizzando l’enzima come catalizzatore: misure end point (all’equilibrio) per la determinazione specifica di uno o più composti, l’identificazione di microrganismi (presenza/assenza di un enzima), il dosaggio vitamine (l’enzima funziona, oppure un organismo target cresce, se si formano cofattori).

Una reazione per essere utilizzata nel dosaggio di analiti deve avere determinate caratteristiche: si deve formare (o consumare) una specie facilmente rilevabile (cioè che assorbe la luce nel visibile o nell’ultravioletto) e quindi facilmente quantificabile mediante uno spettrofotometro, l’equilibrio deve andare a completamento: l’equilibrio chimico deve essere spostato verso i prodotti, la quantità residua del substrato da quantificare all’equilibrio deve essere trascurabile. Le misure della concentrazione di una specie si basano sulla determinazione di un singolo composto che può formarsi in seguito ad una reazione semplice o a diverse reazioni accoppiate (per la rilevazione, o per spostare l’equilibrio), oppure sulla determinazione di più composti presenti in un’unica miscela iniziale con più enzimi in opportuna sequenza.
Vediamo di seguito alcuni esempi.
Un esempio di determinazione di un singolo composto con reazione semplice è il dosaggio di glutammato. In tale determinazione, un enzima converte il glutammato, che è presente nel campione, in alfa-chetoglutarato. Il glutammato si ossida e il NAD+ si riduce in NADH, la cui formazione può essere monitorata misurando l’assorbanza a 340 nm. La variazione di assorbanza è in relazione alla concentrazione di glutammato.

Un esempio di determinazione di più composti grazie all’utilizzo di reazioni accoppiate è quella del glucosio e fruttosio. Gli enzimi Esochinasi e G6Pdh permettono di dosare il glucosio. La successiva aggiunta dell’isomerasi permette di dosare anche il fruttosio (e l’eventuale aggiunta di invertasi può consentire di dosare il saccarosio). Pertanto, in un solo kit c’è la possibilità di determinare più analiti. Dopo l’aggiunta di esochinasi e glucosio 6-fosfato deidrogenasi si misura l’assorbanza, il cui incremento è legato alla presenza di glucosio. Si procede all’aggiunta di fosfofruttoisomerasi e in tal caso l’aumento di assorbanza è messo in relazione alla presenza di fruttosio.

ELISA e dosaggi immunochimici

I dosaggi immunochimici si basano sull’utilizzo di proteine. Tra i dosaggi di questa famiglia, il più utilizzato è il test ELISA, che si basa sull’utilizzo di anticorpi. Si distingue un test ELISA DIRETTO in cui l’anticorpo è legato al pozzetto, e un test ELISA INDIRETTO in cui ad essere legato al pozzetto è l’antigene. È bene precisare che, per quanto questa definizione sia piuttosto diffusa, non tutti i testi di riferimento sono concordi sul significato attribuito a “diretto” e “indiretto” quando riferiti a dosaggi ELISA.
Si distingue inoltre tra ELISA COMPETITIVO diretto (anticorpo legato al pozzetto) e indiretto (antigene legato al pozzetto) ed ELISA NON-COMPETITIVO diretto (anticorpo legato al pozzetto) e indiretto (antigene legato al pozzetto).

Nell’ELISA diretto, non competitivo (detto anche sandwich), l’anticorpo è legato al pozzetto. L’analita (antigene) viene legato. L’anticorpo primario riconosce il complesso antigene anticorpo formatosi. Un anticorpo secondario marcato da un enzima si lega a sua volta all’anticorpo primario. La variazione di colore che si sviluppa a seguito del legame tra l’anticorpo marcato con l’enzima e l’anticorpo secondario legato all’antigene è messa in relazione alla concentrazione dell’analita ricercato. La specie “in difetto” è l’antigene; dalla sua quantità dipende quanto anticorpo secondario si attacca e quindi quanto colore si forma.
L’ELISA sandwich non è sempre il test più adatto. La scelta dipende dall’analita che si sta ricercando che, infatti, deve avere almeno due siti di riconoscimento; solitamente è un test adatto per determinare composti ad alto peso molecolare come ad esempio una proteina, mentre se si sta cercando un piccolo peptide, una vitamina o un antibiotico può non essere adatto perché è difficile che ci siano due siti di riconoscimento per gli anticorpi.

Nell’ELISA indiretto (antigene legato al pozzetto) l’anticorpo primario lega l’antigene (analita). L’anticorpo secondario, coniugato con un enzima, riconosce il complesso antigene-anticorpo. Lo sviluppo di colore è messo in relazione alla concentrazione di analita presente.

Nell’ELISA competitivo indiretto (antigene legato al pozzetto) in assenza di analita, l’anticorpo primario si fissa all’antigene legato al pozzetto. In presenza di analita (antigene libero in soluzione) parte dell’anticorpo primario non si fissa al pozzetto e viene allontanato mediante un lavaggio. Maggiore è la quantità di analita, minore è la quantità di anticorpo primario che si è legata.

Nell’ELISA competitivo diretto (anticorpo legato al pozzetto) per la competizione si usa un antigene coniugato all’enzima.

Negli ELISA (diretto e competitivo indiretto) commercializzati come kit non viene utilizzata l’accoppiata anticorpo primario/anticorpo secondario, ma si utilizza direttamente un anticorpo specifico per l’analita coniugato a un enzima (anticorpo coniugato). L’utilizzo di un anticorpo primario e di un secondario è più flessibile ma richiede più passaggi. L’utilizzo di un unico anticorpo coniugato è meno flessibile ma richiede meno passaggi.

Un’altra tipologia di test immunochimici molto diffusa è quella dei Lateral Flow Assay. Comprendono una striscia costituita da diverse porzioni: il sample pad è la porzione a livello della quale viene assorbito il campione che sale per capillarità attraverso la strip. A livello del conjugated pad ci sono degli anticorpi di cattura che bloccano l’analita. Segue la test line dove sono presenti anticorpi che riconoscono il complesso antigene anticorpo che si è formato e la linea di controllo che serve per verificare la validità del test.

Metodi molecolari

I metodi molecolari “vedono” solo DNA (e non altri componenti). Sono metodi in cui i fattori di amplificazione delle sequenze originali sono esponenziali, sono ragionevolmente specifici, sono capaci di enormi sensibilità, richiedono la disponibilità di primer specifici e di DNA di buona qualità.

La reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction, PCR) è una tecnica che consente la moltiplicazione (amplificazione) di frammenti di DNA dei quali si conoscano le sequenze nucleotidiche iniziali e terminali. L'amplificazione mediante PCR consente di ottenere in vitro molto rapidamente le quantità di DNA necessaria per le successive applicazioni. Conoscere le sequenze nucleotidiche iniziali e finali è fondamentale per sintetizzare “chimicamente” i primer nucleotidici. Per la PCR si utilizzano primer deossiribonucleotidici (oligonucleotidi di DNA). Data una regione (frammento) di DNA da amplificare, i primer sono oligonucleotidi complementari alla regione iniziale del filamento stampo. Per amplificare un frammento di DNA servono due primer, uno per ogni estremità.

L’estrazione del DNA è relativamente semplice nel caso di prodotti grezzi o semilavorati (sementi, farine, fiocchi), consente di impiegare protocolli di estrazione rapidi (ad esempio impiego di resine o silice, kit di estrazione rapida), mentre è più complessa nel caso di prodotti lavorati, che richiedono protocolli di estrazione più lunghi e delicati (ad esempio metodo CTAB, metodo del fenolo-cloroformio).

Trattamenti industriali quali filtrazioni, tostature, trattamenti con calore a pH acido, possono sia degradare il DNA in modo tale da renderlo non analizzabile (ad esempio confetture o succhi di frutta, alcuni corn flake), sia eliminare ogni traccia di DNA dal prodotto (ad esempio oli raffinati di semi, sciroppi di glucosio, alcune lecitine di soia).
Talvolta l’estrazione può essere difficile da eseguire per effetto dell’interferenza o del trattamento nell’estrazione. In questi casi, pertanto, non è possibile effettuare la PCR.

La PCR tradizionale consente solamente una valutazione qualitativa (presenza/assenza) di un determinato gene (il risultato ottenibile è infatti di tipo end-point e la presenza dell’amplificato viene valutata mediante elettroforesi). La PCR Real-time (PCR quantitativa o qPCR) consente un monitoraggio continuo dell’andamento dell’amplificazione (ottenuto mediante sonde marcate con fluorofori) e rende pertanto possibile valutare il momento in cui si ha la replicazione esponenziale del frammento di DNA, correlando la quantità di DNA amplificato con la quantità iniziale di DNA presente.

Tutti i metodi descritti vengono spesso applicati in alimenti che hanno subito trattamenti. I processi hanno un ruolo nel determinare delle modificazioni sull’alimento. È possibile che un determinato trattamento comporti il mancato rilascio dell’analita, l’alterazione chimica o strutturale, l’introduzione di interferenti, ligandi (ad es. polifenoli), interferenza con attività enzimatica. Nella scelta di un metodo piuttosto che un altro, pertanto, è importante considerare le caratteristiche della matrice e i trattamenti tecnologici subiti dall’alimento.

 


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