Le metodiche analitiche rapide

Le metodiche analitiche rapide

Un estratto dell'intervento di Patrizia Restani incentrato sulla determinazione di allergeni, contaminanti biologici, micotossine, residui di farmaci e altri contaminanti chimici

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08

Ottobre
2018

Tratto dall'intervento della professoressa Patrizia Restani, Full Professor in Food Chemistry - Facoltà di Scienze del Farmaco - Università degli Studi di Milano

L’esigenza della maggior parte delle aziende che fanno controllo qualità è di realizzare un numero molto elevato di analisi in un tempo molto breve. Il mercato oggi presenta una vasta offerta di kit basati su metodi rapidi perché è necessario dosare e tenere sotto controllo sempre più sostanze. Uno dei vantaggi è quello di poter realizzare molte analisi in tempi rapidi e con una spesa contenuta. Il controllo di qualità classico ricerca contaminanti di natura chimica (micotossine, pesticidi ecc.) e microbiologica (salmonella, listeria e altri patogeni).

Nel settore alimentare è molto importante anche la determinazione di sostanze caratterizzanti per poter dichiarare in etichetta specifiche indicazioni nutrizionali e sulla salute (un claim come, ad esempio, "ad alto contenuto di fibre"). I tempi di analisi del laboratorio dipendono da diversi fattori tra cui il personale, le attrezzature e le tecniche applicate.

I metodi rapidi prevedono l’utilizzo di kit abbastanza semplici (come un lettore di piastre, ad esempio) che non richiedono personale altamente specializzato, ma una buona manualità ed esperienza in laboratorio.

La metodica utilizzata deve essere rapida, affidabile e con un’idonea sensibilità. Deve cioè essere sufficiente per poter dosare le sostanze ricercate, nell’ordine di grandezza previsto dai limiti di legge.

Tra i metodi rapidi presenti sul mercato i più utilizzati sono le metodiche enzimatiche, immunochimiche (ELISA) e il lateral flow. Sia i metodi enzimatici, sia gli immunochimici vengono comunemente applicati su piastre di plastica con tutti i reagenti pronti. I primi si basano su una reazione enzimatica, mentre i secondi sul riconoscimento antigene-anticorpo.
Di seguito si descrivono sinteticamente le caratteristiche principali.

Le metodiche enzimatiche

Un metodo enzimatico si basa sull’utilizzo di enzimi. L’enzima ha un sito attivo che riconosce un substrato specifico e lo trasforma nei prodotti. La metodica prevede il dosaggio, solitamente spettrofotometrico, di uno dei prodotti della reazione enzimatica.

Tra i kit più utilizzati ricordiamo il dosaggio del lattosio e dell’istamina nelle conserve di pesce.

Il dosaggio del lattosio. Il lattosio, lo zucchero del latte, è un disaccaride associato a un’intolleranza determinata dall’incapacità di digerire (e quindi di scindere) lo zucchero nei suoi componenti. Uno dei primi prodotti che l’industria alimentare ha sviluppato per soddisfare le esigenze di persone con tale intolleranza è il latte delattosato. Oggi è possibile ottenere un livello di scissione molto elevato con una quantità di lattosio residua molto bassa. Il kit di analisi è utile proprio per determinare il grado di idrolisi dello zucchero. La metodica, infatti, si basa su una serie di reazioni per dosare o il glucosio o il galattosio. Come risultato della serie di reazioni si forma un prodotto colorato o che comunque assorbe nell’UV. Dalla lettura con lo spettofotometro è possibile avere una determinazione quantitativa del lattosio residuo.

Il dosaggio dell'istamina. Un altro esempio di utilizzo di kit molto diffuso è quello per la determinazione dell’istamina. È noto che il pesce mal conservato produce istamina a causa dell’alterazione (dovuta alla fermentazione condotta da alcuni microrganismi) sull’aminoacido istidina. A seguito dell’assunzione di un prodotto ittico alterato per elevata presenza di istamina, si verificano delle reazioni anche importanti. La presenza di istamina in quantità elevate può determinare la cosiddetta sindrome sgombroide, spesso descritta nei bambini, soggetti considerati più a rischio. Per dosare l’istamina si utilizza l’istamina deidrogenasi che catalizza una reazione a seguito della quale si forma un prodotto di colore arancione che è possibile leggere con un lettore di piastre. Si dosano valori da 20 a 300 ppm, con tempi di reazione di 15 minuti e una preparazione del campione molto rapida e semplice. Tale metodo viene utilizzato in alternativa alla metodica ufficiale in HPLC.

Le metodiche immunochimiche

Il metodo ELISA è un metodo immunochimico che si basa sul riconoscimento antigene anticorpo. Le tipologie principali comprendono l’ELISA sandwich, il metodo indiretto e il metodo competitivo. Gli antigeni possono essere molecole proteiche con funzione immunostimolante (es. allergeni, glutine) o anche altre molecole (contaminanti chimici che si legano ad un’altra molecola in grado di stimolare la reazione anticorpale). Gli anticorpi possono essere monoclonali (riconoscono solo uno specifico epitopo in un antigene) oppure policlonali (riconoscono piu epitopi o più antigeni).

Il metodo sandwich. È il più comune. Per operare sono necessari una piasta a 96 pozzetti o a file mobili, pipette possibilmente multicanale e un lettore di piastre.
Nel metodo sandwich sul fondo dei pozzetti si lega l’anticorpo che funge da ancora. Si aggiungono, in pozzetti diversi, lo standard con l’antigene che va dosato e il campione. Grazie all’utilizzo di un secondo anticorpo, marcato con un enzima legato, si rileva l’antigene ricercato che viene legato in due epitopi diversi, altrimenti i due anticorpi andrebbero in competizione. Successivamente si procede al lavaggio della piastra per eliminare il superfluo.
Il complesso viene identificato attraverso l’aggiunta di un substrato per quell’enzima che lo rileva attraverso un’azione enzimatica con conseguente cambiamento di colore. Il campione viene dosato grazie a una retta di calibrazione.

Il metodo indiretto. In questo metodo sono presenti l’antigene (sul fondo del pozzetto), l’anticorpo primario specifico e l’anti-anticorpo legato all’enzima che agisce sul substrato utilizzato per rilevare l’attività dell’enzima stesso. L’entità dell’attività enzimatica è direttamente proporzionale alla quantità di antigene presente. Uno dei vantaggi dell’utilizzo del metodo indiretto è che l’anticorpo secondario è sempre lo stesso, a differenza del metodo sandwich in cui anche l’anticorpo secondario è specifico per l’antigene.

Il metodo competitivo. In questo caso, nella piastra possono essere fissati antigeni o anticorpi. L’analita “libero” compete con un suo analogo “legato” per il legame all’anticorpo specifico. Si tratta di un metodo molto utilizzato per i contaminanti, quali le micotossine. A differenza del metodo indiretto, in questo caso la lettura è inversamente proporzionale alla concentrazione dell’analita perché ad una maggiore concentrazione di analita “libero” corrisponde una scarsa attività enzimatica e quindi poco sviluppo di colore. L’eventuale positività deve essere confermata da una successiva verifica.

Il Lateral Flow

Si tratta di una tecnica immunochimica rapida per la determinazione della presenza di un antigene specifico. È molto usata per la verifica del livello di pulizia delle superfici. Il campione viene caricato e l’anticorpo marcato (colorato) si lega allo specifico antigene, se presente. Il complesso antigene-anticorpo si lega ad un secondo anticorpo antigene specifico (sandwich). Gli anticorpi che non si sono legati migrano fino alla linea del controllo dove si trova un anticorpo che riconosce l’anticorpo e non l’antigene. Una parte degli anticorpi colloidali viene sempre riconosciuta dalla linea di controllo che deve colorarsi.

In sintesi: i test rapidi che abbiamo visto hanno una notevole importanza perché aumentano la possibilità di controllo da parte delle aziende, sono particolarmente affidabili e presentano rari casi di falsi negativi (nelle quantità di interesse). La rilevazione di falsi positivi (possibile) comporta l’esecuzione di un’analisi di conferma che riguarda però un numero limitato di campioni.


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