La determinazione dei patogeni negli alimenti

La determinazione dei patogeni negli alimenti

Verena Peggion di Merck ha illustrato il funzionamento del sistema Assurance GDS PCR real time senza estrazione di DNA, dalla preparazione del campione all’analisi

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16

Ottobre
2020

Tratto dall'intervento della dottoressa Verena Peggion, Field Marketing - Merck

Le soluzioni proposte da Merck per le analisi microbiologiche per la sicurezza alimentare spaziano in diversi ambiti: dal monitoraggio ambientale e controllo dell’igiene (bioluminometro, campionatori d’aria, piastre da contatto e indicatori della presenza di residui proteici sulle superfici), agli indicatori di qualità (terreni di coltura tradizionali, metodi alternativi e prodotti per la filtrazione), ai test per patogeni (terreni di coltura, diluitori automatici, omogeneizzatori, Metodo Assurance GDS, Transia plate ELISA, metodi rapidi su lateral flow).

La preparazione del campione per l’analisi dei batteri patogeni comprende una serie di fasi: l’arrivo del campione in laboratorio, la pesata del campione, la diluizione nello specifico brodo di pre-arricchimento, l’omogeneizzazione e l’incubazione alla temperatura appropriata e per il tempo appropriato.

In merito alla preparazione del campione, la ISO 6887-1 fornisce le regole generali da seguire per condurre in modo corretto le operazioni preliminari di sospensione e di diluizione decimale, oltre a indicare che tipo di strumentazione utilizzare e come trattare il campione in base alla particolarità della matrice.

Per stabilire la tipologia di mezzo colturale da utilizzare è necessario considerare la tipologia di analisi da effettuare. A ciascun batterio corrisponde un determinato metodo ISO. In caso venissero utilizzati metodi alternativi, è richiesto di seguire le specifiche istruzioni dell’azienda produttrice del metodo alternativo (si tratta comunque di metodi validati).

I terreni utilizzati sono conformi alla ISO 11133:2018. Possiamo distinguere tra due categorie di terreni: i terreni in formula granulare che riducono la formazione di polveri e sono altamente solubili (sono disponibili in diversi formati, da 500 g o anche buste per la preparazione di singoli terreni- readybag) e i terreni pronti all’uso che semplificano il processo di preparazione con un notevole risparmio di tempo.

Il metodo Assurance GDS in PCR real time per la determinazione dei patogeni negli alimenti fornisce risultati in 12-28 ore in funzione del parametro. Tutti i kit sono validati in accordo alla ISO 16140-2 e forniscono estrema accuratezza, dimostrata anche dalle prestazioni pubblicate negli studi di validazione.

Il flusso di lavoro è suddiviso in tre fasi: l’arricchimento, la concentrazione del campione (attraverso l’utilizzo di pickpen magnetica) fino all’analisi PCR.

La tecnologia si basa sul principio della immunoseparazione magnetica (IMS). Gli anticorpi (specifici per un determinato antigene) sono adesi a biglie magnetiche. 1 ml di campione arricchito è unito a 20 microlitri di biglie. Se il patogeno in questione è presente, si legherà alle biglie grazie alla reazione antigene-anticorpo. Utilizzando la pickpen, le biglie con il microrganismo target legato vengono recuperate e analizzate con PCR. Questo metodo offre diversi vantaggi:

  • l’IMS previene la potenziale inibizione della reazione PCR
  • l’IMS separa fisicamente il patogeno target dai componenti potenzialmente inibitori. Il metodo funziona molto bene su matrici difficili (es. cioccolata, spezie)
  • il DNA proveniente da cellule morte non si lega alle biglie (le biglie si legano alle cellule target e non al DNA libero). Il rischio di avere falsi positivi derivanti da cellule morte è minimo.
  • l’IMS minimizza la possibilità di avere falsi positivi rappresentando un primo livello di specificità (reazione antigene-anticorpo specifico per il target).

Questo metodo, inoltre, non prevede che l’operatore conduca operazioni di estrazione di DNA né lisi (non è necessario uno specifico laboratorio dedicato a PCR, la cross contamination da parte di DNA nel corso della preparazione del campione non è possibile, visto che il DNA non viene manipolato).
Infine, il campione utilizzato è un volume elevato (1 ml) che risulta semplice da aliquotare ed è rappresentativo.


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