DNA e PCR: basi molecolari e metodiche

DNA e PCR: basi molecolari e metodiche

Le tecniche di biologia molecolare, oltre alla loro nota applicazione nel settore degli OGM, hanno trovato una sempre più ampia applicazione nel campo delle scienze degli alimenti. Ne ha parlato Marco Arlorio nella sessione plenaria

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11

Ottobre
2018

Tratto dall’intervento di Marco Arlorio - Full Professor of Food Chemistry - Dipartimento del Farmaco - Università del Piemonte Orientale

Le tecniche di biologia molecolare sono oggi utilizzate correntemente come strumento di screening in molteplici ambiti, come la rilevazione indiretta di sostanze allergeniche o l’identificazione di specie, oltre  alla determinazione e la quantificazione di OGM, forse l’applicazione più conosciuta.

La complessità di queste tecniche è correlata anche alla complessità e alla biodiversità dei genomi; nonostante molti di questi siano stati elucidati, alcuni sono ancora parzialmente decodificati, aumentando il grado di complessità relativo alla applicazione della PCR.

A livello analitico la difficoltà prevalente è spesso la fase di estrazione del DNA genomico totale che sia sufficientemente puro e che risulti amplificabile.

Le tre fasi fondamentali che portano all’estrazione del DNA comprendono la lisi cellulare, l’estrazione del DNA, l’isolamento dello stesso e il clean-up. Segue poi la fase di amplificazione, ottenuta mediante Reazione a Catena della Polimerasi in un termociclatore.

La lisi cellulare

Gli approcci utilizzati per ottenere la lisi cellulare sono differenti e diversamente utilizzati. Di seguito si riportano i principali:

  • estrazione con Potter, consistente nell’omogeneizzazione a pestello (tecnica manuale)
  • la crio-estrazione (o cryomilling) che è generalmente considerata una tecnica più efficace
  • la liofilizzazione del materiale fresco, seguita dall’estrazione classica
  • il pre-trattamento con enzimi idrolitici per ottenere un miglior rilascio di materiale genomico dal prodotto.

L’estrazione del DNA

Sia i tempi di estrazione, sia la quantità del DNA genomico estratto, il più puro possibile, dipendono dalla metodica utilizzata. In passato è stata molto impiegata l’estrazione in fenolo-cloroformio, più recentemente sostituita anche per problemi legati alla tossicità delle componenti. Oggi esistono diverse metodiche considerate più sicure ed efficaci.

Tra queste si ricordano, per esempio, i kit di estrazione specifici e adattati alle specifiche esigenze. “Customizzazione” del metodo di estrazione significa testare per una matrice diversi sistemi, valutare resa e purezza, modificare eventualmente i protocolli dei kit commerciali.

Un’altra tecnica è il salting out, che prevede il trattamento con un’apposita soluzione lisante, la successiva aggiunta di specifici reagenti per consentire la precipitazione del DNA.

Infine, ricordiamo l’uso delle microbeads che vengono utilizzate, nella fase successiva alla lisi, per purificare il DNA isolato. Le microbeads possono legare il DNA, oppure possono legare in modo aspecifico sostanze interferenti la reazione, permettendo quindi di purificare il DNA.

La PCR

La PCR, inventata da Kary Mullis, è una tecnica utilizzata per amplificare  specifiche sequenze di DNA grazie all’attività della DNA polimerasi e all’uso di primer (oligonucleotidi di innesco) in un ambiente tamponato idoneo. Il processo comprende la denaturazione dell’elica, il riconoscimento da parte delle sequenze primer del target e l’allungamento delle stesse a opera della DNA polimerasi. In seguito al susseguirsi di cicli termici a diverse temperature (denaturazione, annealing dei primer, estensione) che permettono le diverse fasi, si ottiene l’amplificazione del DNA, che avviene in modalità esponenziale nel tempo permettendo di ottenere grandi quantità di ampliconi specifici.

Più in particolare una volta preparata la miscela di reazione si procede con la PCR trattando il campione a 94°C per 15-30 secondi per ottenere la apertura del duplex (doppia elica) di DNA. Segue l’ibridizzazione che si ottiene raffreddando la miscela per 30-60 secondi affinché ciascun primer si possa appaiare con un filamento di DNA. La soluzione viene poi riscaldata a 72°C, temperatura ideale per l’attività della DNA polimerasi, per 1 o 2 minuti per amplificare frammenti di acido nucleico.

Le applicazioni nel settore alimentare oggi sono molteplici. Le principali vengono elencate di seguito:

  • la determinazione di specie animale e vegetale
  • il riconoscimento varietale/cultivar
  • l’identificazione di patogeni negli alimenti
  • l’identificazione/quantificazione di OGM
  • l’identificazione di mutazioni puntiformi finalizzata al miglioramento genetico
  • l’identificazione di ingredienti “in traccia” nascosti negli alimenti (sostanze presenti in tracce perché derivanti da cross contamination, ad esempio)
  • l’identificazione di organismi potenzialmente capaci di apportare allergeni (si tratta di una tecnica indiretta per determinare la potenziale presenza dell’allergene in relazione al DNA che deriva dall’organismo stesso.

Queste tecniche, inoltre, consentono di definire anche la qualità tecnologica di una matrice alimentare. Per esempio è possibile valutare le caratteristiche di una farina in base alla sua forza (W) analizzando la presenza o assenza di determinati geni.

In tutti i genomi sono presenti dei “microsatelliti”, sequenze ripetute di DNA (1-5 pb) non codificante costituite da unità di ripetizione molto corte disposte secondo una ripetizione in tandem, utilizzabili come marcatori molecolari di loci. Questa applicazione è molto sfruttata per la caratterizzazione varietale in campo vegetale.

Le applicazioni/metodiche legate alla PCR più utilizzate sono di seguito elencate:

  • Real Time PCR
  • Multiplex PCR
  • RAPD
  • Real Time PCR
  • Bar Coding e NGS. Queste ultime, in particolare, risultano particolarmente efficaci in alcuni settori come l’identificazione di specie ittica.

OItre alle tecniche correlate alla PCR, da anni sono studiati diverse sonde e sistemi di detection a livello micro- e nano-strutturato. L’utilizzo degli aptameri, sequenze di acidi nucleici che, essendo in grado di assumere conformazioni specifiche, mostrano la capacità di legare specifiche molecole con alta affinità. Vengono oggi utilizzati per riconoscere specifiche sequenze di interesse o molecole di differenze dimensione molecolare, ma sempre compatibile a quella degli aptameri stessi (es. piccole proteine, micotossine), rappresentando una ulteriore potenzialità nel settore delle tecniche biomolecolari.

Nel futuro questi sistemi basati sull’uso di nuove sonde potranno essere utilizzati largamente nella diagnostica molecolare avanzata, anche in correlazione alla applicazione della nanosensoristica avanzata.


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